Vincenzo Natali déclare souvent que sa passion pour le cinéma est née le jour où il a vu La Guerre des étoiles pour la première fois. Il tourne alors très jeune son premier film en Super 8, un space opéra intitulé Dark force, puis intègre quelques années plus tard le studio d'animation Nelvana grâce à son don pour le dessin. Attiré dans un premier temps par la bande dessinée, il continue de manipuler la caméra sur des courts métrages présentés dans de nombreux petits festivals tout en signant les storyboards de quelques films et épisodes de séries.
Après son entrée dans une école de cinéma canadienne, le futur cinéaste réalise un court métrage particulièrement remarqué, Elevated, sur l'histoire d'un ascenseur possédé. Son ami d'enfance, devenu acteur, David Hewlett qui apparaît dans ce film, tiendra par la suite un rôle dans chacune des autres réalisations de Vincenzo Natali. Son court-métrage est remarqué au point que l'école lui alloue un budget pour réaliser son premier long métrage. Avec 350 000 dollars, Vincenzo Natali met en scène les délires claustrophobiques de six personnes coincées dans le labyrinthe d'un Cube diabolique. L'ingéniosité de sa mise en scène (dans un décor unique) lui vaut de nombreux prix, dont le Grand Prix au Festival de Gerardmer en 1999. Il retrouve en 2002 la veine fantastique et paranoïaque pour son second long métrage, le film d'espionnage futuriste Cypher, emmené par Jeremy Northam et Lucy Liu.
Taxé d'être un réalisateur de films trop "intellectuels", il met en scène en 2003 le surprenant film Nothing. Entre comédie et fantastique, ce troisième long-métrage démontre une nouvelle fois l'indépendance du cinéaste. Vincenzo Natali réalise ensuite un documentaire sur le travail du réalisateur Terry Gilliam, Getting Gilliam (2005), et participe l'année suivante au film collectif Paris, je t'aime. Il revient en 2010 avec le thriller scientifique et horrifique dérangeant Splice, avec en tête d'affiche le couple Adrien Brody- Sarah Polley.