Issu d'une famille d'artistes, Romain Duris intègre après le bac une école de dessin. Mais il est bientôt repéré dans la rue par un directeur de casting à la recherche des héros du Péril jeune, téléfilm réalisé par Cédric Klapisch dans le cadre de la série d'Arte Les Années lycée en 1993. Le succès de ce portrait de groupe - dans lequel figurent également les débutants Vincent Elbaz et Hélène De Fougerolles - est tel que le film sort en salles deux ans plus tard. Entre-temps, Duris apparaît dans Frères : la roulette rouge (1994), un téléfilm signé par un autre cinéaste prometteur, Olivier Dahan.

Look débraillé, sourire charmeur, et de l'énergie à revendre... Romain Duris ne tarde pas à devenir l'un des comédiens les plus populaires de sa génération. Sollicité par la jeune garde du cinéma français (Kounen, Graham Guit), il retrouve Dahan pour le sombre Déjà mort, mais devient surtout l'acteur-fétiche de Klapisch : glandeur à dreadlocks dans Chacun cherche son chat (1996), il incarne le père de... Belmondo dans le film d'anticipation Peut-être (1999). Une forte complicité se noue également avec Tony Gatlif, qui l'emmène en Roumanie à la découverte du monde gitan dans Gadjo Dilo, avec au bout de cette quête initiatique une nomination au César du Meilleur espoir en 1999.

En 2002, l'énorme succès de L'Auberge espagnole, comédie de Klapisch qui relate le quotidien d'une bande d'étudiants Erasmus, marque un tournant dans la carrière de Romain Duris. S'il continue d'être à l'affiche de premiers films audacieux, d'Osmose au quasi-expérimental Shimkent hotel en passant par 17 fois Cécile Cassard, il prend désormais part à des projets de plus grande ampleur : donnant la réplique à Adjani dans Adolphe, il enfile le costume de gentleman cambrioleur dans la superproduction Arsène Lupin (2004). Toujours fidèle à Tony Gatlif (Exils) et à Klapisch (Les Poupées russes, Paris), il impressionne dans De battre mon coeur s'est arrêté d'Audiard (2005) : fébrile et habité, il interprète un agent immobilier véreux sauvé par le piano.

Irrésistible dans ses rôles de "bobo" décalé et séducteur (Dans Paris, L'Age d'homme... maintenant ou jamais, L'Arnacoeur), Romain Duris s'embarque également dans des projets aussi divers que le film à costumes Molière (2007) de Laurent Tirard, l'adaptation du roman fantastique Et après (2008) - son deuxième long métrage anglophone après CQ (2003) - et le très sombre Persécution (2009) de Patrice Chéreau, oeuvre pour laquelle il partage l'affiche avec Charlotte Gainsbourg et Jean-Hugues Anglade. Deux ans après avoir retrouvé Klapisch à Paris en 2008, il s'approche de Catherine Deneuve et Marina Foïs pour mieux s'en éloigner dans L'Homme qui voulait vivre sa vie d'Eric Lartigau.

Après avoir prêté sa voix au héros masculin du film d'animation Raiponce, s'essayant ainsi à l'exercice du doublage, il incarne un patron charismatique mais indécis, amoureux de Déborah François, dans la comédie réjouissante Populaire. En 2013, il entre dans l'univers surréaliste et foisonnant du réalisateur atypique Michel Gondry, et se fait l'interprète de Colin dans L’Écume des jours, adaptation du roman incontournable de Boris Vian où il se donne corps et âme à Audrey Tautou. Il retrouve ensuite une nouvelle fois la comédienne dans le troisième volet de la saga de Klapisch, intitulé Casse-tête chinois.

Homme travesti chez François Ozon (Une nouvelle amie) puis chômeur s'improvisant tueur à gages chez le regretté Pascal Chaumeil (Un petit boulot), Romain Duris prend également part au sulfureux thriller Iris, quatrième film réalisé par Jalil Lespert. Aimant les rôles difficiles, il joue un homme inquiétant suspecté de meurtre dans Fleuve noir, un tortionnaire sadique dans Le Déserteur et un père de famille devant s'occuper de ses enfants après la disparition de sa femme dans Nos batailles. En 2021, l'acteur revient à un registre plus grand public avec Eiffel, dans lequel il campe le célèbre constructeur Gustave Eiffel.