Né d'un père chercheur en biologie à l'Université du Kansas et d'une mère nutritionniste, James Marsden entreprend d'abord des études de journalisme à la Oklahoma State University. C'est durant ces années d'études qu'il découvre finalement sa voie de carrière : être comédien. Il prouve rapidement qu'il peut être aussi à l'aise dans des teen movies populaires tels que Comportements troublants (1998) ou Fausses Rumeurs (2000) qu'au générique de petites productions indépendantes (The 24th day).

Mais le véritable détonateur de sa carrière reste X-Men où il interprète le puissant Cyclope, bientôt suivi par un rôle récurent dans la série Ally McBeal. Après une apparition dans le loufoque Zoolander signé par Ben Stiller, James Marsden ré-endosse le costume et le laser du mutant Cyclope dans X-Men 2 (2003) et X-Men l'affrontement final (2006). Il poursuit parallèlement son chemin dans l'univers des super-héros avec Superman Returns, qui lui permet de retrouver le réalisateur des deux premiers volets de la saga X-Men : Bryan Singer. S'il continue à creuser la veine de la comédie comme le souligne ses prestations dans 27 robes ou le musical Hairspray, il est sollicité par Richard Kelly pour le thriller de SF The Box, dans lequel il donne la réplique à Cameron Diaz. En 2010, l'acteur devrait reprendre le rôle-titre des Chiens de paille, jadis tenu par Dustin Hoffman, dans un remake réalisé par Rod Lurie.