Fille de militaire, Julianne Moore passe son enfance à déménager entre les États-Unis et l'Allemagne. Elle fait ses études au sein de l'école américaine de Francfort dont elle sort diplômée en 1979, puis décide de suivre une formation à l'École des Beaux Arts de l'université de Boston. Elle débute sa carrière d'actrice dans des pièces de théâtre comme Serious Money de Caryl Churchill.

Au milieu des années quatre-vingt, elle commence à travailler pour la télévision, en apparaissant dans de nombreux soap operas et autres séries comme B.L. Stryker (1989). C'est ainsi qu'elle gagne un Emmy Award pour sa performance dans le feuilleton As the world turns en 1988. Il faut attendre 1990 pour la voir faire ses premiers pas sur le grand écran. C'est en effet dans Darkside les contes de la nuit qu'elle fait sa première apparition au cinéma, dans le rôle de la malheureuse victime d'une momie. On la retrouve deux ans plus tard dans le thriller La Main sur le berceau aux cotés de Rebecca de Mornay.

1993 lui permet d'apparaître le temps de deux scènes dans l'un des cartons de l'année : Le Fugitif avec Harrison Ford et Tommy Lee Jones. Mais c'est surtout l'occasion pour elle de tirer son épingle du jeu au sein du choral Short Cuts de Robert Altman. Dans le Los Angeles des années 1990, le spectateur suit les destins croisés de pas moins de vingt-deux personnages. Julianne Moore participe ensuite au dernier long-métrage du réalisateur français Louis Malle dans Vanya, 42nd street.

Elle gravit petit à petit les échelons de la hiérarchie hollywoodienne et joue les seconds rôles dans les grosses productions Neuf mois aussi aux côtés de Hugh Grant, et Assassins avec Sylvester Stallone et Antonio Banderas. Mais c'est dans le cinéma indé qu'elle décroche à 35 ans son premier premier rôle. Todd Haynes, dont elle deviendra l'actrice fétiche, la choisit en 1995 pour camper une femme au foyer aisée qui développe une allergie à tout ce qui l'entoure dans Safe. 

Steven Spielberg, interpellé par son interprétation dans Le Fugitif, lui propose en 1997 d'incarner le docteur Sarah Harding dans Le Monde perdu sans même lui faire passer d'audition. La même année, elle accepte de jouer le rôle d'une actrice porno des seventies dans Boogie nights de Paul Thomas Anderson, et se retrouve citée en 1998 pour l'Oscar du meilleur second rôle féminin. Elle retrouve le cinéaste pour son projet suivant, Magnolia (1999), qui n'est pas sans rappeler, par sa forme chorale et sa façon chaotique d'entrechoquer les destinées de ses personnages, le Short Cuts d'Altman qui l'avait révélée.  

Entre-temps, elle participe à deux films boudés à leur sortie. Si le premier, The Big Lebowski des frères Coen, acquiert le statut de film culte au fil des années, il n'en est pas de même pour Psycho, exercice de style de Gus Van Sant qui reprend plan par plan, en couleurs, Psychose d'Hitchcock. Une copie dont la démarche, qui n'est ni un remake ni une parodie, laisse la critique comme le public perplexe. 

Nombreux sont les réalisateurs à vouloir diriger cette actrice rousse au physique élégant et raffiné. Elle commence la décennie des années 2000 avec sa première nomination à l'Oscar de la meilleure actrice grâce à La Fin d'une liaison. Elle est contrainte de décliner le rôle d'Audrey Dunn dans Incassable pour se glisser dans la peau de l'agent Clarice Starling dans Hannibal de Ridley Scott. En 2003, elle se paie le luxe d'être nommée à l'Oscar de la meilleure actrice pour son personnage d'épouse modèle dans les années 50 confrontée à l'échec de son mariage dans Loin du paradis, ainsi qu'à celui du meilleur second rôle dans The Hours, où elle côtoie Meryl Streep et une Nicole Kidman méconnaissable dans la peau de Virginia Woolf.

Si elle continue d'enchaîner les projets dans des genres divers, comme la romance (Une affaire de coeur, Chassé-croisé à Manhattan), la SF (Mémoire effacée, Next) et le drame policier (La Couleur du crime), ces films sont des flops critiques et publics. C'est dans le cinéma d'auteur qu'elle parvient à se renouveler à partir de la deuxième moitié des années 2000. Ainsi, elle collabore avec Alfonso Cuaron (Les Fils de l'homme), Fernando Meirelles (Blindness), Todd Haynes (pour la troisième fois avec I'm Not There), le styliste Tom Ford (A Single Man) et Atom Egoyan (Chloé).

En 2010, entourée d'Annette Bening et de Mark Ruffalo, l'actrice revient à un registre plus léger sur le sujet néanmoins sérieux de l'homoparentalité, dans Tout va bien, The Kids Are All Right, réalisé par Lisa Cholodenko. Après avoir joué la femme infidèle de Steve Carrell dans la comédie romantique Crazy, Stupid, Love, la mère de Chloë Grace Moretz dans l'horrifique Carrie, la vengeance et une star de cinéma dans Maps To The Stars de Cronenberg (qui lui vaut le prix d'interprétation au Festival de Cannes 2014), Julianne Moore décroche enfin en 2015 l'Oscar de la meilleure actrice pour son personnage de mère de famille atteinte de la maladie d’Alzheimer dans le bouleversant Still Alice.

Elle poursuit dans un registre similaire avec Free Love où elle campe une lesbienne atteinte d’un cancer en phase terminale. Parallèlement, la comédienne se produit dans des blockbusters à l'image du Septième fils, Hunger Games - La Révolte : Partie 1 (2014) et 2 et Kingsman: Le cercle d'or (2017). Prolifique et versatile, l'actrice se montre aussi à l'aise dans la farce grinçante Bienvenue à Suburbicon de George Clooney, que dans les remakes de Gloria (Gloria Bell) et After The Wedding (Après le mariage), ou encore dans la peau de l'icône féministe Gloria Steinem (The Glorias). Elle prend aussi part à la première réalisation de Jesse Eisenberg, When You Finish Saving the World, présentée à la Semaine de la Critique du Festival de Cannes.

Après Le Musée des merveilles, elle retrouve en 2023 et pour la cinquième fois Todd Haynes dans May December, inspiré par l'affaire Mary Kay Letourneau. Elle y incarne une ancienne professeure et mère de famille dont le mari est son ancien élève de vingt ans son cadet.