Après un stage d'expression théâtrale au Théâtre National de Bretagne, Jacques Gamblin devient le régisseur de cet établissement. Se destinant par la suite au métier de comédien, il débute au cinéma en 1988 dans Périgord noir de Nicolas Ribowski, puis enchaîne les petits rôles chez Claude Lelouch (Il y a des jours... et des lunes en 1989, La Belle histoire en 1991), Robert Guédiguian (A la vie, à la mort !, 1994) et Laurent Bénégui (Au petit Marguery).
Mais ce n'est qu'en 1996, avec le succès de Pédale douce, que le public découvre véritablement le comédien, grimé en homme d'affaires homosexuel et strip-teaseur : une prestation qui lui vaut une nomination pour le César du Meilleur second rôle masculin. Ne se laissant pas cantonner dans un registre comique, Gamblin multiplie les tournages sous la direction de grands cinéastes comme Claude Chabrol (Au coeur du mensonge, 1999), Jean Becker (Les Enfants du marais, id.) ou Bertrand Tavernier qui, en lui offrant le premier rôle de Laissez-passer, lui permet de décrocher le Prix d'interprétation masculine au Festival de Berlin en 2002. Entre temps, sa prestation aux côtés de Sandrine Bonnaire dans le drame sentimental Mademoiselle est également saluée par la critique.
Fort de cette consécration, l'acteur alterne petites productions, comme le troublant Carnages (2002) ou l'intimiste 25° en hiver (2004), et projets plus ambitieux tels que le polar A la petite semaine (2003) de Sam Karmann ou l'adaptation ciné des Brigades du Tigre en 2005. Après avoir de nouveau collaboré avec Bertrand Tavernier pour Holy Lola (2004), récit initiatique sur les affres de l'adoption à l'étranger, Jacques Gamblin dévoile sa sensibilité de père de famille dans des films aussi divers que Les Irréductibles (2006), Nos retrouvailles (2007) et Le Premier jour du reste de ta vie (2008), une performance qui lui vaut une nomination au César du Meilleur acteur en 2009.
Son charme est également exploité à l'écran par Isabelle Mergault, qui en fait l'amant de Michèle Laroque dans Enfin veuve, tandis que Claude Chabrol aime à le plonger dans l'atmosphère tendue de son polar Bellamy aux côtés de Gérard Depardieu et Clovis Cornillac. Sa ressemblance physique avec Van Gogh lui vaut d'incarner le peintre hollandais dans le moyen métrage biographique Moi, Van Gogh. Il interprète par la suite un sympathisant de Lionel Jospin dans le césarisé Le Nom des gens en 2010 puis un adepte du cerf-volant dans Ni à vendre, ni à louer l'année suivante. En 2012, le comédien change complètement de registre en se glissant dans la peau d'un flic expérimenté et solitaire, à la mine patibulaire, traquant un tueur en série (Lambert Wilson) dans l'inquiétant A l'aveugle de Xavier Palud.
En prise avec un redoutable gangster (Carlo Brandt) en compagnie d'Olivier Marchal dans Le Jour attendra, l'acteur livre ensuite une performance aussi physique qu'émouvante dans De toutes nos forces. Suivent 24 jours, la vérité sur l'affaire Ilan Halimi où il campe un policier aidant la famille Halimi confrontée au gang des barbares et la comédie dramatique Week-ends où il quitte sa compagne Karin Viard. Fin 2016, l'acteur entreprend un stage de réconciliation pour tenter un ultime rapprochement avec son fils dans la comédie Père Fils Thérapie !. Tournant relativement peu, Jacques Gamblin campe le rôle-titre du biopic L'Incroyable Histoire du facteur Cheval (2018) et incarne un père de famille cherchant à reconquérir sa femme par le biais d'un voyaga familal en Grèce dans On sourit pour la photo (2022).