Fille de Catherine Deneuve et de Marcello Mastroianni.
Enfant, Chiara Mastroianni fait des apparitions aux côtés de ses parents (A nous deux, 1979, Les Yeux noirs, 1987). Inscrite en Deug d'italien à Censier, elle décide cependant de devenir actrice, encouragée par son ami Melvil Poupaud. André Téchiné lui offre son premier vrai rôle, celui de la fille de... Catherine Deneuve dans Ma saison préferée (1993), composition qui lui vaut une nomination au César du Meilleur Espoir. Si elle donne la réplique à son père dans Trois vies et une seule mort, Chiara Mastroianni s'affranchit vite de l'influence de ses parents en devenant une égérie du cinéma d'auteur. Héroïne du drôle et macabre Journal du séducteur (1996), elle intègre la même année la troupe de Desplechin (Comment je me suis disputé...).
Audacieuse dans ses choix, l'actrice au visage serein et gracieux s'éprend d'un Xavier Beauvois séropositif dans N'oublie pas que tu vas mourir (1996) et surprend en adepte du SM dans Nowhere puis en prostituée pleine d'assurance dans A vendre (1998). A l'affiche de plusieurs premiers films, tels Carnages ou Il est plus facile pour un chameau..., dans lequel elle incarne la soeur de Valeria Bruni Tedeschi, Chiara Mastroianni inspire aussi les maîtres : Raoul Ruiz lui offre le rôle d'Albertine dans son Temps retrouvé et, surtout, Manoel de Oliveira lui fait jouer une Princesse de Clèves des temps modernes dans La Lettre (2000).
Passant du thriller (Six-Pack) à la comédie décalée (Akoibon), elle tourne en Italie avec Castellitto ou Francesca Comencini. Après une parenthèse en-chantée (l'album Home), elle défend à Cannes en 2007 deux projets très originaux, une adaptation animée de la BD Persepolis de Marjane Satrapi et Les Chansons d'amour de Christophe Honoré, cinéaste qui lui confiera le rôle principal de Non ma fille, tu n'iras pas danser (2009) et de Homme au bain (2010). Emouvante en jeune femme effacée, voire sacrifiée (L'Heure zéro, Un conte de Noël en 2008), elle laisse au contraire libre cours à sa fantaisie devant la caméra de Sophie Fillières (Un chat un chat).
Après avoir été dirigée par Bruno Podalydès dans Bancs publics (Versailles rive droite), elle retrouve une nouvelle fois le réalisateur Christophe Honoré pour son second film musical, Les Bien-aimés, dans lequel elle chante aux côtés de sa mère, Catherine Deneuve, qui interprète sa mère pour la seconde fois.
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