Diplômé en droit, Nino Manfredi effectue ses premières armes d'acteur en intégrant la troupe théâtrale de Vittorio Gassman au Piccolo Theatro de Milan et de Rome. Devenu doubleur d'acteurs italiens et étrangers, il débute au cinéma en 1949 dans le drame Torna a Napoli avec un très modeste cachet. Après avoir tourné sous la direction de Mauro Bolognini dans Les Amoureux, présenté au Festival de Cannes en 1955, il obtient son premier grand rôle, celui de Nando, en 1959 dans L'Impiegato de Gianni Puccini, une comédie satirique dont il a écrit le scénario. Très rapidement, il atteint une popularité identique à celle de ses compagnons de jeu Totò, Vittorio Gassman et Alberto Sordi.

Entamant une éblouissante carrière sous la houlette des illustres Dino Risi (Il Gaucho, 1965) et Ettore Scola (Nos héros réussiront-ils à retrouver leur ami mystérieusement disparu en Afrique ?, 1968 ; Nous nous sommes tant aimés, 1974), Nino Manfredi passe derrière la caméra en 1962 avec la réalisation de "L'Avventura di un soldato", un des sketches du film Amours difficiles. Le comédien réitérera l'expérience à deux reprises : en 1970 avec la satire anticléricale Miracle à l'Italienne, primé comme Meilleure première oeuvre au Festival de Cannes 1971, et en 1981 avec Nu de femme.

Multipliant à l'écran les personnages malchanceux, pauvres victimes et ne parvenant guère à se révolter, Nino Manfredi incarne un homosexuel émouvant dans Une poule, un train et quelques monstres de Dino Risi, un émigré italien indésirable dans Pain et chocolat, Ours d'argent au Festival de Berlin 1974, ou encore le patriarche d'un bidonville romain dans Affreux, sales et méchants d'Ettore Scola. Parmi ses autres rôles marquants figure celui de Geppetto, le papa de Pinocchio, dans la version tournée par Luigi Comencini en 1971.

Sollicité jusqu'à la fin de sa vie, il se montre également très actif à la télévision en interprétant les séries Un commissaire à Rome (1993) et Linda et le brigadier (1997). Mais en juillet 2003, l'acteur italien est victime d'un accident cérébral, accident à la suite duquel il décèdera moins d'un an après.