Soeur aînée de Meg Tilly.

Jennifer Tilly se passionne très tôt pour le théâtre, qu'elle étudie à la Belmont High School de Victoria, en Colombie britannique. Installée à Los Angeles, elle se produit sur scène avec les pièces One shoe off de Tina Howe, qui lui vaut un Theater World Award, Boy's life ou encore Tartuffe. Elle remporte d'ailleurs un Dramalogue Award pour sa prestation dans Vanities. Parallèlement, dans les années 80, Jennifer Tilly apparaît dans les séries télévisées Capitaine Furillo, Remington Steele, ou encore Clair de lune.

Dès lors, le Septième Art s'intéresse à elle. C'est en 1984 avec No small affair, une comédie de Jerry Schatzberg, qu'elle décroche son premier rôle au cinéma. Dans le même registre, elle enchaîne avec High spirits (1988) de Neil Jordan. A l'aube des années 90, elle fait preuve d'éclectisme, figurant aux génériques de films à tonalité plus dramatique (Susie et les Baker Boys; Les Doors d'Oliver Stone) ou davantage orientés vers l'action (Agaguk de Jacques Dorfmann, Guet-apens). Toutefois, les personnages qu'elle interprète à l'écran restent encore discrets.

Jennifer Tilly connaît la consécration en 1994, grâce à Coups de feu sur Broadway de Woody Allen. Son interprétation de la chorus-girl Olive Neal lui vaut d'être nominée à l'Oscar et à l'American Comedy Award de la meilleure actrice dans un second rôle. Dès lors, elle n'hésite pas jouer de son charme troublant en incarnant une criminelle bisexuelle dans le polar Bound des frères Wachowski. En 1997, elle est citée à l'American Comedy Award du meilleur second rôle pour son interprétation de Samantha Cole, une cliente arriviste de Jim Carrey, dans la comédie Menteur, menteur.

En marge de ses nombreux rôles dans des petites productions (Parrain malgré lui, Perfect Opposites), l'actrice prête sa voix à de multiples personnages animés. Outre celle de Tiffany, fiancée de Chucky et mère du fils de Chucky, elle est tour à tour Camille Stout dans Stuart Little, Celia dans Monstres & Cie et la vache Grace dans La Ferme se rebelle (2004).

Côté septième art, après avoir été la reine Gunhilda de Terry Gilliam dans l'étrange Tideland (2005), l'actrice se fait plus rare et se cantonne à des rôles plus ou moins importants dans des films souvent inconnus du grand public (L'Initiation de Sarah, Deal - The Game Is On, 30 Beats). Joueuse de poker à haut niveau (elle remporte plusieurs tournois et partage la vie d'un joueur), Jennifer Tilly s'installe parallèlement à la télévision dans Out of Practice pour une saison, et fait quelques apparitions dans Les Experts, Modern Family, Drop Dead Diva et le dessin animé Les Griffin, où ses talents de doubleur s'illustrent une fois de plus.