Né en Roumanie, Sebastian Stan et sa mère déménagent à Vienne lorsqu'il a 8 ans. 4 ans plus tard, il suit sa mère à New-York lorsque cette dernière épouse le directeur d'une école privée de la ville. Durant ses années dans "La Grosse Pomme", il étudie au Rockland Country Day School et joue dans plusieurs scènes théâtrales. Il participe également à plusieurs productions au camp d'été du Stagedoor Manor ; cette expérience le pousse alors à se diriger plus sérieusement dans une carrière d'acteur. Diplômé par la suite de l'Université Rutgers du New Jersey, il passe une année à Londres en jouant au Shakespeare's Globe Theatre. 

A son retour aux Etats-Unis, Sebastian commence à tourner dans des films indépendants tels que Tony N'Tina's Wedding, Red Doors ou bien encore The Architect. Parallèlement, il incarne également des personnages à faible degré d'importance dans des séries comme New-York, Police Judiciaire avant d'obtenir un rôle plus récurrent dans Gossip Girl durant 3 saisons (2007-2009). 

Surfant sur sa relative notoriété, on le retrouve de plus en plus dans des films en vue tels que Rachel se marie, Toy Boy ou bien Black Swan. Mais c'est en 2011 que sa carrière prend un tournant non négligeable lorsqu'il interprète Bucky Barnes, le meilleur ami de Captain America dans Captain America : First Avenger. Dans la foulée, il intègre le casting de la série Once Upon A Time par le biais du rôle du Chapelier Fou et joue dans la mini-série Political Animals, retraçant le parcours politique de l'ancienne secrétaire d'Etat américaine Elaine Barrish. 

Sebastian Stan reprend son rôle de Bucky Barnes dans Captain America, Le Soldat de l'Hiver en 2014, incarnant le redoutable Soldat de l'Hiver, puis dans le troisième volet de la lucrative franchise, Captain America Civil War, qui sort deux ans plus tard. Entre ces deux films Marvel, l'acteur campe l’un des trois enfants de Meryl Streep dans Ricki and the Flash et cherche à sauver Matt Damon qui se retrouve Seul sur Mars.