Dan Aykroyd débute sa carrière de comédien au théâtre et dans les night clubs. Manager du club Le 505 de Toronto, il fait la rencontre de John Belushi, alors à la recherche de nouveaux talents pour l'émission National Lampoon Radio Hour. En 1975, tous deux sont choisis pour le tout nouveau projet télévisuel de Lorne Michaels : le Saturday Night Live. Le succès est au rendez-vous. Après ses apparitions dans la comédie canadienne Love at first sight (1977) et le parodique 1941 de Steven Spielberg (1979), il partage aux côtés de son fidèle ami Belushi, tout vêtu de noir, l'affiche du musical Blues brothers (1980). Le film est une telle réussite qu'une suite (Blues brothers 2000) sort en 1997, malheureusement sans John Belushi, décédé en 1982.
Seul, Dan Aykroyd se trouve de nouveaux partenaires de jeu comiques, issus comme lui du Saturday Night Live, parmi lesquels Eddie Murphy (Un fauteuil pour deux, 1982) et Chevy Chase (Drôles d'espions, 1985). Aux côtés de Bill Murray (autre transfuge du SNL) et Harold Ramis, il remporte un énorme succès public grâce à S.O.S. fantômes (1984) et S.O.S fantômes II (1989). Tout en restant dans le registre de la comédie, il joue dans Indiana Jones et le Temple maudit, mène l'enquête aux côtés de Tom Hanks dans Dragnet et épouse une extra-terrestre en la personne de Kim Basinger. Il tente ensuite une incursion dans le drame avec Miss Daisy et son chauffeur (1989). Sa prestation est saluée par une nominationà l'Oscar du Meilleur second rôle masculin.
Malgré sa nomination à l'Oscar et l'envie d'élargir son répertoire, cette "bonne bouille" du cinéma américain doit souvent se contenter, dans les années 90, de simples rôles secondaires comme dans la comédie dramatique My girl (1991), le thriller Les Experts (1992), la biographie Chaplin (1992), la romance Feeling Minnesota (1996) ou encore le drame d'époque Chez les heureux du monde (2000).
Après avoir incarné le Capitaine Thurman de Pearl Harbor, en 2001, Dan Aykroyd retourne à ses premières amours, la comédie. Gouverneur dans le Evolution d'Ivan Reitman (son réalisateur de S.O.S. Fantômes), il tourne Le Sortilège du scorpion de Jade sous la direction de Woody Allen, incarne le père de Britney Spears dans Crossroads, joue le médecin d'Adam Sandler dans Amour et amnésie ainsi qu'un voisin bien envahissant dans Un Noël de folie !. Après s'être illustré dans Quand Chuck rencontre Larry, Dan Aykroyd est à l'affiche en 2009 de la comédie War, Inc., aux côtés de John Cusack.