James Lesure suit des études de théâtre en Californie avant de faire ses débuts sur la scène anglaise. De retour à Los Angeles, il incarne Macduff dans une représentation de la tragédie de Shakespeare, "Macbeth". À partir de 1995 et de son rôle dans le téléfilm The O.J. Simpson Story, il multiplie les apparitions dans des séries télé : New York Police Blues, Dingue de toi, Diagnostic : Meurtre, Seinfeld et The Drew Carey Show pour n'en citer que quelques-unes. En 1998, il devient l'un des héros de Pour le meilleur, rôle qu'il tient pendant 5 saisons. Après des personnages récurrents dans Alias, Half & Half et Division d'élite, il se charge de la sécurité du casino de Las Vegas (2003).
Côté cinéma, James Lesure débute en 1995 par une figuration dans USS Alabama de Tony Scott. Il apparaît quatre ans plus tard dans la comédie Giving It Up, puis tient un second rôle dans le film d'horreur Le Cercle - The Ring 2 (2005).
