S'il n'en a pas écrit le scénario, La Cinquième colonne est adapté d'une idée d'Alfred Hitchcock sous l'impulsion de David O. Selznick qui souhaitait produire le film. Jugeant le scénario final trop médiocre, Selznick a tenté de le revendre à plusieurs sociétés de production. C'est finalement Frank Lloyd qui a récupéré le script et qui a lancé la production avec Universal Studios.
La Cinquième colonne est entrée en production fin 1941, en pleine Seconde Guerre mondiale, au moment de l'attaque de Pearl Harbor, évènement qui entraîna l'entrée des Etats-Unis dans le conflit. De nombreuses scènes prévues dans de véritables usines ont dû être finalement tournées en studio, les lieux étant massivement utilisés pour la production militaire.
Comme dans tous ses films, Alfred Hitchcock apparaît également dans La Cinquième colonne par le biais d'une scène dans les rues de New-York et de façon anecdotique. En revanche, il avait tourné un autre plan où il apparaissait en compagnie de sa secrétaire Carol Stevens, et où ils interprétaient un couple sourd-muet sensé discuter dans le langage des signes (Stevens était censé le gifler car il lui aurait fait une proposition indécente). La scène a été refusée par Universal pour cause d'atteinte à l'image des handicapés.