Fils du réalisateur et comédien Leo Penn et de l'actrice Eileen Ryan, Sean Penn, frère aîné de Chris Penn, est formé au Group Repertory Theatre de Los Angeles. Il y aborde la comédie et la mise en scène, et se consacre au théâtre. Après quelques apparitions à la télévision, le comédien décroche, en 1981, un rôle dans Taps de Harold Becker, un film qui révèle également Tom Cruise. N'abandonnant pas pour autant le théâtre, Sean Penn accumule les premiers rôles, jouant sous la direction de John Schlesinger (Le Jeu du faucon) ou Louis Malle (Crackers, resté inédit en France).

En 1986, il épouse Madonna qui lui donne la réplique dans la comédie policière Shanghai surprise (1986). L'échec commercial et critique du film n'empêche pas Sean Penn de s'imposer à Hollywood. Il campe le fils de Christopher Walken dans Comme un chien enragé (1985) et s'illustre en nouvelle recrue policière dans Colors de Dennis Hopper. Un tempérament fort, rebelle, lui permet de composer les "violents" (il est un soldat américain violeur dans Outrages et le condamné à mort de La Dernière marche) ou les loosers magnifiques (She's so lovely avec sa deuxième épouse Robin Wright Penn). Cyniques et manipulateurs, les personnages qu'il campe appartiennent aussi bien au film noir (L'Impasse, U-Turn, ici commence l'enfer), au thriller (The Game), qu'au film de guerre (La Ligne rouge).

Comédien reconnu et consacré (Prix d'interprétation au Festival de Cannes 1997), Sean Penn mène aussi une carrière de cinéaste. Il réalise en 1991 son premier long métrage, The Indian runner, dont il signe également le scénario. Pour son deuxième film, Crossing guard, il dirige Jack Nicholson en père de famille vengeur et désespéré. Il retrouve ce dernier pour les besoins de The Pledge, un drame policier adapté d'un roman de Friedrich Dürrenmatt et présenté en compétition officielle au Festival de Cannes 2001. Se faisant plus rare à l'écran, Sean Penn accepte toutefois de tourner sous la direction de Clint Eastwood dans Mystic river (2003), pour lequel il obtient l'Oscar du meilleur acteur en 2004. Face à Kevin Bacon et Tim Robbins, il incarne un père endeuillé sur le point de commettre l'irréparable.

Délibérément à l'écart du cinéma hollywoodien et des grands studios, l'acteur s'épanouit dans des productions indépendantes comme 21 grammes (2004) d'Alejandro González Inárritu et The Assassination of Richard Nixon (id.), où il donne sa chance au réalisateur Niels Mueller. Il fait équipe pour la première fois avec Sydney Pollack en 2005 pour le thriller politique L'Interprète aux côtés de la prolifique Nicole Kidman. Sean Penn retourne derrière la caméra en 2007 et permet à Emile Hirsch d'obtenir son premier très grand rôle grâce à Into The Wild, épopée tragique au milieu des paysages indomptables des Etats-Unis. Il endosse ensuite le rôle poignant de Harvey Milk dans le biopic par Gus Van Sant de l'homme politique américain, militant pour les droits civiques des homosexuels assassiné en 1978 à San Francisco.

Le comédien retrouve Terrence Malick pour le métaphysique Tree of Life (2011). Toujours en 2011, il campe une rockstar déchue et au look extravagant dans This Must Be the Place, présenté comme Tree of Life au Festival de Cannes. Par la suite, il interprète l'impitoyable chef de la mafia Mickey Cohen dans Gangster Squad (2013), avant de rejoindre le casting de La Vie Rêvée de Walter Mitty, la nouvelle fantaisie de Ben Stiller. En 2015, il se plonge dans le cinéma d'action avec Gunman de Pierre Morel. Cette même année, le cinéma français lui rend hommage en lui remettant un César d'honneur pour l'ensemble de sa prestigieuse carrière. En 2016, il met en scène The Last Face, un mélodrame sur fond d’intervention humanitaire particulièrement mal reçu par la critique. Sean Penn se fait ensuite plus rare.

En 2019, on le retrouve aux côtés de Mel Gibson dans The Professor and the Madman, qui raconte la collaboration entre un philologue écossais et un médecin militaire interné dans un hôpital psychiatrique, qui amena à la création de l'Oxford English Dictionary. L'année suivante, il réalise et campe le personnage principal de Flag Day, dans lequel il fait tourner ses enfants Dylan et Hopper Penn, puis joue un personnage secondaire (mais marquant !) dans la pépite de Paul Thomas Anderson, Licorice Pizza. Il revient en 2024 au thriller sombre avec Black Flies (présenté à Cannes 2023) de Jean-Stéphane Sauvaire, où il interprète un ambulancier expérimenté.