Vincent D'Onofrio fait ses premières armes de comédien dans de petits films universitaires à New York, avant d'intégrer au début des années 80 les prestigieux cours d'art dramatique de l'Actors Studio et de l'American Stanislavski Theatre. Cette expérience l'amène à se produire sur différentes scènes de Broadway et d'entamer sa carrière cinématographique dans le film comique The First turn-on !!, en 1983.
Vincent d'Onofrio se fait remarquer par son inquiétante performance dans le film de Stanley Kubrick, Full metal jacket, pour lequel il n'hésite pas à grossir d'une trentaine de kilos. Cette performance lui permet de travailler avec les plus grands réalisateurs : pour Oliver Stone et Spike Lee, il joue dans deux films historiques, JFK et Malcolm X, où il interprète le même personnage, Bill Newman.
Son regard inquiétant amène très souvent Vincent d'Onofrio à interpréter des rôles troubles, que ce soit dans des superproductions (Edgar le cafard extraterrestre dans MIB Men in Black, 1997), des comédies dramatiques (Feeling Minnesota) ou des thrillers (The Cell, 2000, où il campe un tueur en série face à Jennifer Lopez). En 2002, cet acteur qui se métamorphose souvent pour les besoins d'un rôle, incarne un trafiquant de drogue déjanté dans le film noir Salton sea, porté par Val Kilmer.
L'année 2001 marque l'arrivée de Vincent d'Onofrio au casting de la série télévisée New York Section Criminelle dans le rôle du Détective Robert Goren. Le succès public est immédiat. Il revient au cinéma, en 2006, aux côtés Jennifer Aniston et Vince Vaughn, dans la comédie romantique La Rupture. En 2009, il est à l'affiche du drame Little New York aux côtés d'Ethan Hawke. Malgré ses quelques rôles, D'Onofrio reste très discret sur les écrans.
La mi-2011 marque une bascule dans sa carrière. Après 10 ans d'existence, New York Section Criminelle s'arrête et le natif de Brooklyn abandonne les habits de l'enquêteur Robert Goren. Suite à cet évènement, il décide de se consacrer plus à sa carrière au cinéma et enchaîne les tournages. Ainsi, il apparaît en compagnie de Bruce Willis dans Fire with fire, vengeance par le feu et Sinister avec Ethan Hawke, qu'il retrouve pour la 6ème fois de sa carrière.
En 2013, Vincent D'Onofrio apparaît par le biais de seconds rôles dans plusieurs productions (parfois inédites en France), dont la comédie Pawn Shop Chronicles où il donne la réplique à Elijah Wood et Paul Walker, le violent The Necessary Death of Charlie Countryman ou encore le film de prison Evasion, porté par deux monuments du cinéma d'action en les personnes de Sylvester Stallone et Arnold Schwarzenegger.
Privilégiant les seconds rôles au cinéma, Vincent varie les genres et apparaît dans le drame Le Juge, le thriller bourrin Night Run, le blockbuster lucratif Jurassic World, les horrifiques Le Cercle : Rings et Death Wish, la comédie CHiPs, ainsi que les westerns Les Sept Mercenaires et The Kid. Au début des années 2020, l'acteur privilégie les biopics, comme Dans les yeux de Tammy Faye, Dumb Money et Wildcat de son comparse Ethan Hawke.
S'il est actif côté grand écran, Vincent D'Onofrio trouve parallèlement plusieurs rôles intéressants dans des séries. Parmi elles : Daredevil, où il campe l'imposant et terrifiant gangster Wilson Fisk (un personnage qu'il reprend dans Hawkeye, Echo et Daredevil: Born Again), ainsi que Godfather of Harlem, dans laquelle il joue Vincent Gigante, un ancien boxeur devenu membre de la Cosa nostra.