Gloria Stuart commence à prendre des cours de théâtre à l'Université de Californie de Berkeley, et monte alors sur les planches pour quelques petites productions dans des théâtres de quartier. Elle signe son premier contrat en 1932 avec Universal Studios, et la même année, tourne le film Tête brûlée de John Ford. Elle devient la favorite du réalisateur James Whale, qui la dirige successivement dans Une soiree etrange (1932), L'Homme invisible (1933) puis dans The Kiss Before the Mirror (1933).

Elle retrouve John Ford pour Je n'ai pas tué Lincoln (1936), mais par la suite, s'enchaîne pour l'actrice une série de films qui passent inaperçus. Elle se tourne alors vers la 20st Century Fox, mais le même scénario se répète. Elle se retire alors de la scène et travaille pour le syndicat des acteurs américains, se consacre à la peinture et à quelques one-woman shows qu'elle donne à New York, en Autriche et en Italie.

Après trois décennies hors de l'écran, elle fait son retour en 1975 dans un téléfilm puis dans quelques séries télévisées. Son mari, le scénariste Arthur Sheekman, décède en 1978. En 1982, elle survit à un cancer du sein. C'est finalement grâce au rôle de Rose DeWitt Bukater dans Titanic (1998), qu'elle atteint vraiment le succès : elle est nominée pour l'Oscar du meilleur second rôle. Depuis, on a pu la voir aux côtés de Mel Gibson dans The Million Dollar Hotel (2000), ainsi que dans de petits rôles pour la télévision. Elle reste la personne la plus âgée à avoir été nominée pour un Oscar.