Après avoir bouclé ses études, Justin Long, membre de la troupe de théâtre de son université, débute sa carrière en 1999 avec un petit rôle dans la comédie de science-fiction Galaxy Quest. Il décroche ensuite un rôle récurrent dans la série télévisée Ed, mais c'est en 2001 qu'il se fait véritablement connaître du grand public avec le rôle principal du film d'horreur Jeepers Creepers, le chant du diable.

Populaire dès ses débuts, le jeune Justin Long est vite courtisé. Parrallèlement à une activité théâtrale, il donne ainsi la réplique à Britney Spears dans Crossroads (2002), joue à la balle au prisonnier dans le déjanté Même pas mal ! (2004) aux côtés de Ben Stiller et Vince Vaughn, côtoie Lindsay Lohan dans La Coccinelle revient (id.), et incarne le coiffeur de Jennifer Aniston dans La Rupture (2006), prouvant ainsi son attachement au registre comique.

En 2007, Justin Long franchit un cap indéniable en étant le sidekick de Bruce Willis dans le blockbuster d'action Die Hard 4 - retour en enfer. L'année suivant cette superbe promotion, il prête sa voix au personnage principal d'Alvin et les Chipmunks. En 2009, l'acteur est sur tous les fronts : il est la voix d'une drôle de souris dans La Légende de Despereaux, figure au casting quatre étoiles de Ce que pensent les hommes aux côtés notamment de Ben Affleck, Scarlett Johansson et Drew Barrymore, et est le héros du film d'horreur Jusqu'en enfer de Sam Raimi.

Dans After.Life (2009), Justin Long tente de changer de registre et troque la comédie romantique pour le thriller. Il retourne néanmoins à la comédie pure avec le rôle vedette de Taking chances. L'année suivante, il retrouve sa partenaire à la ville Drew Barrymore, pour la comédie romantique Trop loin pour toi.