Né à Godalming dans le Surrey au Royaume-Uni, Sam Worthington et sa famille emménagent très tôt en Australie, à Perth. Après des études au National Institute of Dramatic Art de Sydney, le jeune homme s'impose d'abord sur les planches dans Juda Kiss montée au Belvoir Street Theatre. Se distinguant également dans des séries télévisées (JAG), il obtient finalement son premier rôle au cinéma en 2000 dans Bootmen.

Ce n'est que trois années plus tard, dans le drame Somersault, que Sam Worthington attire pour de bon les projecteurs. Sa prestation lui vaut en effet le Prix du Meilleur Acteur par l'Australian Film Institute. Il obtient alors quelques seconds rôles dans des productions américaines tournées en Australie (The Great Raid, 2005)

Alors qu'il démontre également son envie de réaliser (le court-métrage Enzo), sa carrière d'acteur s'emballe. Un temps pressenti pour remplacer Pierce Brosnan dans le rôle de James Bond, il est remarqué par James Cameron qui le choisit pour tenir le rôle principal de son nouveau film de science-fiction : Avatar. Recommandé par le réalisateur, il tourne ensuite aux côtés de Christian Bale dans un autre blockbuster : Terminator Renaissance.

Véritable étoile montante d'Hollywood, l'acteur prête en 2010 ses traits à Persée dans le remake du Choc des titans dirigé par Louis Leterrier. Après avoir enchaîné les superproductions, il change de registre en 2011 dans Last Night, drame romantique dans lequel il interprète un homme déchiré entre sa compagne Keira Knightley et sa collègue Eva Mendes. Il est également en tête d'affiche de deux sombres thrillers : L'Affaire Rachel Singer suivi de Killing Fields, une glaçante histoire de meurtres en série.

Mais l'action reste son registre de prédilection. En témoignent ses prestations dans Dos au mur (2012), La colère des Titans (id.) et Sabotage (2014) où il donne la réplique à Arnold Schwarzenegger. Preuve que les rôles physiques sont décidément faits pour lui : Sam Worthington incarne un alpiniste dans Everest, qui retrace le désastre ayant eu lieu en 1996 dans lequel huit personnes ont péri dans une redoutable tempête, ainsi qu'un soldat dans Tu ne tueras point, un film de guerre signé Mel Gibson.

Le natif de Godalming poursuit avec le drame Le Chemin du pardon, les thrillers d'action The Professional et La Fracture, le film de SF Titan, le biopic Lansky et le western The Last Son. Parallèlement, le comédien incarne le charismatique meurtrier dans la série policière Sur ordre de Dieu, qui se déroule au sein d'une société mormone dans les années 1980. En 2022, il reprend son rôle de Jake Sully dans le très attendu Avatar : la voie de l'eau, toujours mis en scène par James Cameron.