Fils du célèbre scénographe Alejandro Luna, Diego Luna débute sur les planches dès l'âge de sept ans. Il partage ensuite son temps entre le théâtre et la télévision, deux activités qui le rendent très populaire au Mexique. Après une apparition dans Avant la nuit de Julian Schnabel, il se révèle sur grand écran en 2001, aux côtés de son compatriote Gael Garcia Bernal, dans Et... ta mère aussi ! d'Alfonso Cuaron. Sa prestation, très remarquée, l'impose d'emblée comme l'un des grands espoirs du cinéma mexicain.

Diego Luna séduit ensuite Hollywood, s'illustrant notamment aux génériques de Frida, Open range ou encore Dirty Dancing 2 où il révèle ses talents de danseur héritier de Patrick Swayze. N'oubliant pas ses racines en jouant dans Nicotina qui le récompense de l'Ariel Film Award du Meilleur Acteur, il décroche en 2004 un second rôle dans Le Terminal de Steven Spielberg qui lui ouvre un peu plus les portes de la renommée et lui permet d'être l'une des deux vedettes du thriller Criminal, en compagnie de John C. Reilly.

L'acteur surprend en 2008 dans un film de piètre envergure, Mister Lonely de Harmony Korine. Il y interprète le sosie de Mickael Jackson qui rencontre lors d'un concours d'autres sosies esseulés. L'année est fructueuse pour lui qui, après avoir joué l'un des amants de Harvey Milk (de Gus Van Sant), incarne le frère de Gael García Bernal dans Rudo y Cursi de Carlos Cuaron. Le film relate les déboires entre Rudo et Cursi, deux frères issues d'une famille rurale mexicaine qui aspirent à la richesse.

En 2010, il passe derrière la caméra pour réaliser son premier film de fiction, après s'être attelé à un documentaire sur le boxeur Chavez : Abel raconte l'histoire d'un petit garçon de neuf ans, solitaire et introverti, qui décide un jour de devenir le chef de famille. Devant ce miracle, nul ne proteste. Jusqu’au jour où un homme sonne à la porte : son père.

Second rôle dans Contrebande et Elysium, Diego Luna campe l'ignoble Jonah dans Blood Father et rejoint le casting du très attendu Rogue One: A Star Wars Story, premier spin-off de la célèbre saga intergalactique qui sort en 2016. Cette même année, il repasse derrière la caméra pour les besoins du road movie Mr. Pig avec Danny Glover et Maya Rudolph dans les rôles principaux.