Après avoir écumé les cafés-théâtres dans les années 70, Paul Reubens crée sur scène le personnage de Pee-Wee Herman, homme-enfant excentrique et insouciant qui ne se départit jamais de son nœud papillon rouge. Cet hurluberlu attachant a droit à sa propre émission de télévision sur CBS, Pee-Wee's Playhouse, mais c'est son passage sur grand écran en 1985, avec le Pee-Wee Big Adventure de Tim Burton, qui apporte la gloire à l'acteur.
Paul Reubens reprend ensuite son rôle iconique pour Big Top Pee-Wee et travaille à nouveau sous la direction de Tim Burton en incarnant le père du Pingouin dans Batman, le défi et en prêtant sa voix au personnage de Lock dans L'Etrange Noël de M. Jack.
Inculpé pour exhibitionnisme après avoir été arrêté en 1991 en train de se masturber dans un cinéma pornographique de Floride, Paul Reubens, qui a reconnu les faits dans cette affaire, voit sa carrière connaître un gros coup d'arrêt. Après une parenthèse de quelques années, il est de retour sur les plateaux, s'illustrant notamment dans les films Matilda, Dr. Dolittle, Mystery Men et Blow.
Paul Reubens, qui interprète à nouveau le père du Pingouin dans la série Gotham, retrouve une dernière fois son personnage de Pee-Wee dans Pee-Wee's Big Holiday, un film diffusé sur Netflix.