Avec une mère professeur de dessin, John Lasseter est très tôt passionné par l'univers de l'animation. Il s'initie alors à la peinture et au dessin. Il est encore au lycée lorsqu'il se décide à postuler pour devenir stagiaire au sein des Walt Disney Animation Studios. John Lasseter est alors le second étudiant à être admis à suivre le programme de CalArts, centre de formation Disney destiné à l'étude du dessin et de la photographie. Il clôture ses quatre années d'études en réalisant son premier court métrage d'animation, Lady & the Lamp en 1979. Puis une fois son diplôme en poche, il est engagé au département longs métrages d'animation. Il participe alors aux films Rox et Rouky et Le Noël de Mickey.

En 1983, Ed Catmull, le fondateur de Pixar, lui fait découvrir le potentiel de la technologie numérique qu'offre Lucasfilm. John Lasseter rejoint alors l'équipe de création de Pixar l'année suivante. En collaboration avec Bill Reeves, il imagine un court métrage, dont les rôles principaux sont tenus par des lampes de bureau : Luxo Jr est alors nommé en 1986 pour l'Oscar du meilleur court métrage d'animation. Après une longue série de court métrage de 1979 à 1992, John Lasseter se lance dans le long.

En 1995, il révolutionne le monde du cinéma d'animation en signant le premier film réalisé entièrement en image de synthèse, Toy Story. L'univers de ces jouets prenant vie loin du regard des humains permet au jeune réalisateur de recevoir un oscar spécial. Il enchaîne les succès avec 1001 Pattes et Toy Story 2. Avec Monstres & Cie, en 2001, il change de casquette pour celle de producteur exécutif qu'il garde pour Le Monde de Nemo deux ans plus tard.

Malgré quelques tensions entre Disney et Pixar dues à de multiples négociations concernant les accords liant les deux sociétés et une proposition de rachat, John Lasseter est nommé vice-président du service création de Pixar et obtient la reconnaissance ultime de ses pairs en recevant le prestigieux Art Directors Guild Award pour son "exceptionnelle contribution à l'imaginaire cinématographique" ainsi qu'un diplôme honoraire de l'American Film Institute. En 2006 et après six ans d'absence, il revient à la réalisation, en combinant sa passion pour la mécanique et celle pour l'animation, avec Cars, l'histoire d'une jeune voiture de course impétueuse.

Entre 2007 et 2011, il enchaîne les films en tant que producteur exécutif, preuve de sa volonté de faire progresser le cinéma d'animation : entre Ratatouille, WALL·E, Là-haut, La Princesse et la grenouille ,Toy Story 3 et Raiponce, les studios Pixar ne se sont jamais aussi bien portés. Il faut attendre l'année 2011 pour que John Lasseter revienne à la réalisation, en proposant une suite à son grand succès Cars, qu'il réalise avec la collaboration de Brad Lewis. Une voiture du film est d'ailleurs inspirée de John Lasseter, qui a pu s'essayer pour la première fois de sa vie à l'exercice du doublage, en l'honneur des 25 ans de Pixar.