Née dans la région de Pérouse, Monica Bellucci commence sa carrière dans le mannequinat. Après des études de droit, elle s'oriente vers la comédie et tourne dans un téléfilm de Dino Risi, Vita Coi Fligi (1990), avant d'obtenir son premier rôle important dans La Riffa (1991) de Francesco Laudadio. Peu de temps après, elle est repérée par Francis Ford Coppola qui lui offre un petit rôle dans son Dracula en 1992.
Elle enchaîne quelques films en Italie, avant de débarquer en France, où elle se fait connaître avec L'Appartement (1996) de Gilles Mimouni. C'est sur le tournage de cette romance qu'elle fait la rencontre de Vincent Cassel, son futur mari. Les deux amants se donnent notamment la réplique dans les sulfureux Dobermann (1997) de Jan Kounen et Irréversible (2002) de Gaspar Noé, ainsi que dans le thriller d'espionnage Agents secrets (2004) de Frédéric Schoendoerffer. La pulpeuse Italienne déploie également ses charmes dans de grosses productions françaises comme Le Pacte des loups (2001) et Astérix et Obélix : mission Cléopâtre (2002).
Parallèlement, elle entame une carrière internationale, reprenant le rôle tenu à l'origine par Romy Schneider dans Suspicion (2000), le remake américain de Garde à vue, et se retrouvant face à Bruce Willis dans Les Larmes du soleil (2003) d'Antoine Fuqua. Elle apparaît également au générique des deux derniers volets de la saga Matrix : Matrix Reloaded et Matrix Revolutions. Dirigée par Mel Gibson dans le rôle de la grande pêcheresse Marie-Madeleine pour La Passion du Christ (2004), elle ensorcelle littéralement Les Frères Grimm (2005) et apporte sa touche glamour au film de gunfights Shoot'em-up (2007).
En France, Monica Bellucci tourne pour de grands cinéastes comme Bertrand Blier (Combien tu m'aimes ?, 2005), Alain Corneau (Le Deuxième souffle, 2007), et va jusqu'à flirter avec l'étrange en s'immisçant dans l'univers de Jean-Christophe Grangé (Le Concile de pierre, 2006) et celui de Marina De Van (Ne te retourne pas, 2009). A l'approche de la cinquantaine, elle poursuit sa carrière aussi bien aux Etats-Unis (L'Apprenti Sorcier) qu'en France (Un été brûlant, 2011). Elle rejoint aussi le casting de la comédie chorale Des gens qui s'embrassent (2013) et campe deux ans plus tard une James Bond Girl dans 007 Spectre.
Privilégiant le cinéma d'auteur, Monica trouve des rôles dans On the Milky Road d'Emir Kusturica, L'Homme qui a vendu sa peau de Kaouther Ben Hania et Les Fantasmes de Stéphane Foenkinos et David Foenkinos (ce qui ne l'empêche pas de tourner pour Martin Campbell dans Mémoire meurtrière). En 2024, elle est à l'affiche du film choral Paradis Paris, ainsi que de Beetlejuice Beetlejuice de Tim Burton (lequel est le nouveau compagnon de l'actrice). Parallèlement, elle goûte aux joies du petit écran et apparaît dans son propre rôle dans Twin Peaks: The Return et Dix pour cent, et incarne la petite amie de Philippe Rebbot dans L'Amour flou.