Après deux années dans la compagnie théâtrale du "Gutrie Theater" dans sa ville natale de Minneapolis, T.R. Knight s'installe à New York où il s'illustre à Broadway dans la pièce "Noises Off" (2001) face à Peter Gallagher, puis dans "Tartuffe". Il apparaît à la télévision à partir de 2003 en tant que personnage régulier dans l'unique saison de la série Charlie Lawrence. Il enchaîne avec des rôles de guest-star dans Frasier (2003), New York Section Criminelle (2004) et Les Experts avant de s'établir au Seattle Grace Hospital dans la série à succès Grey's Anatomy (2005) sur ABC. Il y incarne un jeune interne secrètement amoureux du personnage d'Ellen Pompeo.