Née d'une femme au foyer et d'un docteur, Kelly McGillis est l’aînée de trois sœurs. Après ses années lycée à Newport, elle fréquente le Pacific Conservatory of the Performing Arts au Allan Hancock College de Santa Maria. Puis, elle décide d'abandonner ses études secondaires et se rend à New York pour étudier le théâtre à la Juilliard School, d'où elle sort diplômée en 1983.

Multipliant les castings, Kelly McGillis fait sa première apparition dans un épisode du soap On ne vit qu'une fois, et trouve son premier rôle au cinéma dans la comédie dramatique Reuben, Reuben. Elle poursuit avec le drame Sweet Revenge et surtout Witness. Dans ce thriller porté par Harrison Ford, elle incarne une jeune femme amish dont le fils est témoin d'un meurtre.

Mais c'est l'année suivante qu'elle obtient son rôle le plus célèbre, avec Top Gun, célèbre film d'action dans lequel elle joue l'instructrice Charlotte "Charlie" Blackwood, dont la superstar du moment Tom Cruise tombe amoureux. Le film réalise 357 millions de dollars de recettes mondiales rien qu'avec sa sortie en salles... Elle poursuit avec Les Accusés, Winter People et Cat Chaser.

Durant les années 1990, Kelly McGillis tend à se faire plus discrète. On peut tout de même la voir dans Grand Isle, Gentleman Babe, L'Irrésistible North, Tour de contrôle ou Premier regard. Une tendance qui s'accentue davantage dans les années 2000 et 2010, même si elle ne disparaît pas totalement des écrans comme en témoigne son rôle de professeure de poésie homosexuelle dans Cercle intime en 2001.

Parallèlement, Kelly McGillis mène une carrière sur les planches depuis ses débuts. Parmi les pièces dans lesquelles elle apparaît, nous pouvons mentionner Don Juan (1982), The Sea Gull (1985), Peccadillo (1985), The Merchant of Venice (1988), Twelfth Night (1989), Mary Stuart (1990), Hedda Gabler (1994), Mourning Becomes Electra (1997), Measure for Measure (1999) et The Graduate (2004).

En 2008, l'actrice incarne une colonelle de l'armée homosexuelle dans la série The L Word (2008). Une prestation qui lui permet de faire son coming out (elle épouse une femme en 2010). On la voit également dans les films d'horreur Stake Land (2010) et The Innkeepers (2011), le thriller We Are What We Are (2013), les téléfilms Trouver l'amour à Sugarcreek (2014) et Un amour interdit (2017).

Depuis les années 2000, Kelly McGillis se consacre surtout à l'enseignement en donnant des cours d'art dramatique à New York. Elle offre par ailleurs un soutien psychologique aux personnes toxicomanes et alcooliques dans un centre de désintoxication.

Au sujet de sa non-participation à la suite de Top Gun, Top Gun : Maverick (dont la sortie est prévue pour 2022), la comédienne a expliqué : "Personne ne m'a contacté et je ne pense pas qu'ils y aient pensé. Je suis vieille, je suis grosse et je fais mon âge. Ce n'est pas ce qu'ils cherchent, mais je préfère être bien dans ma peau à mon âge plutôt que de faire semblant."

Laurent Schenck