Contrairement au Docteur Mabuse premier du nom tourné en muet en 1922, Le Testament du docteur Mabuse est un film parlant, le deuxième de la carrière de Fritz Lang après M le Maudit tourné deux ans plus tôt.
Parallèlement aux prises de vue allemandes du Testament du docteur Mabuse s'est déroulé le tournage d'une version française du film, au titre identique, signé Fritz Lang et René Sti. C'est cependant la version originale qui est passée à la postérité.
Le Testament du Docteur Mabuse est le deuxième d'une longue série de film consacré au criminel Docteur Mabuse. Suite du Docteur Mabuse réalisé en 1922 par Fritz Lang, le film se verra lui-même doté d'une suite, Le Diabolique Docteur Mabuse, toujours signé Fritz Lang en 1959. Deux ans plus tard, c'est l'Allemand Werner Klingler qui réalise un remake du film, avant que le personnage ne deviennent un héros récurrent du cinéma fantastique, que l'on retrouve notamment dans L' Invisible Docteur Mabuse de Harald Reinl (1962) ou dans Dr M. de Claude Chabrol (1990).
Comme treize autres films de Fritz Lang (dont Metropolis et M le Maudit), Le Testament du docteur Mabuse a été scénarisé par Thea von Harbou, script attitré du réalisateur durant sa première période allemande et par ailleurs sa femme de 1922 à 1933.
Métaphore de la terreur nazie déjà à l'oeuvre en Allemagne selon son réalisateur, Le Testament du docteur Mabuse est interdit par Joseph Goebbels, alors ministre de la propagande et de l'information du régime, dès 1933. Ce même Goebbels n'hésite cependant pas à proposer une place à Fritz Lang dans ses services. Quelques mois après la sortie avortée de son film, Fritz Lang décide de quitter l'Allemagne pour Paris puis les Etats-Unis.
Le Testament du docteur Mabuse marque la dernière des dix collaborations entre Fritz Lang et l'acteur Rudolf-Klein Rogge qui incarne le docteur Mabuse. Ce dernier avait notamment joué dans Le Docteur Mabuse en 1922 et Metropolis en 1927. Les deuxièmes aventures du docteur Mabuse marque également la fin de la carrière du comédien Georg John, apparu à onze reprises devant la caméra de Fritz Lang, notamment dans Metropolis et M le Maudit (1931).
Tout comme son premier Docteur Mabuse, Le Testament du docteur Mabuse de Fritz Lang est basé sur un roman homonyme écrit par le Luxembourgeois Norbert Jacques.