Née d'une mère professeur d'anglais et d'un père ingénieur chimiste, Jennifer Garner marche dans les pas de son père dans un premier temps, en suivant des études de chimie à la Denison University. Puis elle se laisse finalement tenter par la comédie à la fin de ses études, et change totalement de cursus en prenant des cours de théâtre et de danse, qu'elle pratique depuis l'âge de neuf ans. S'installant à New York, elle exerce un job d'hôtesse d'accueil pour arrondir ses fins de mois, tout en décrochant en parallèle de petites apparitions dans des téléfilms comme Zoya (1995) et Rose Hill (1997); ou des rôles mineurs dans Harry dans tous ses états (1997) de Woody Allen, la teenage comédie Eh mec, elle est où ma caisse ? (2001) et la mégaproduction Pearl Harbor (id.) de Michael Bay.

Prostituée de luxe dans Arrête-moi si tu peux (2003), Jennifer Garner doit la consécration internationale à ses prouesses d'agent secret dans la série à succès Alias, et à sa prestation de super-héroïne sexy dans Daredevil (2003) et le spin off Elektra (2005). Variant les genres, elle s'essaie à la comédie romantique avec 30 ans sinon rien (2004) et Ma vie sans lui (2006) avant de revenir au film d'action avec Le Royaume (2007). La même année, sa prestation dans le touchant (et gros succès) Juno révèle une actrice capable d'évoluer dans des registres différents des personnages forts incarnés jusqu'alors. En 2009, elle est à l'affiche de Hanté par ses ex, une nouvelle comédie romantique, dans laquelle elle donne la réplique à Matthew McConaughey, un habitué du genre.

La comédienne retrouve d'ailleurs McConaughey en 2013 pour tourner Dallas Buyers Club. Dans la peau d'un texan atteint du SIDA, l'acteur remporte l'Oscar du meilleur acteur en 2014. Jennifer y incarne quant à elle un médecin venant en aide à ce patient très spécial. Entre-temps, l'actrice multiplie les gentilles comédies familiales ou romantiques (Valentine's Day, Alexander et sa journée épouvantablement terrible et affreuse, La Drôle de vie de Timothy Green, Arthur, un amour de Milliardaire). À la fin de l'année 2014, l'ex Sydney Bristow de Alias brille dans Men, Women & Children de Jason Reitman qui brosse le portrait de lycéens, leurs rapports, leurs modes de communication, l’image qu’ils ont d’eux-mêmes et leur vie amoureuse. Le film aborde ainsi plusieurs enjeux sociétaux, comme la culture des jeux vidéo, l’anorexie, l’infidélité, la course à la célébrité et la prolifération de contenus illicites sur Internet.

Après avoir donné la réplique à Al Pacino dans Danny Collins, Jennifer retourne en 2016 à la comédie romantico-dramatique, son genre de prédilection, avec Joyeuse fête des mères aux côtés de Julia Roberts, sous la direction de Garry Marshall (Pretty Woman). La même année, elle affronte Kevin Spacey transformé en matou dans Ma vie de chat avant de rejoindre Bryan Cranston dans le drame Wakefield.