Fille d'une enseignante et d'un cadre d'Air France, Hélène Fillières grandit entre l'Europe, le Brésil et les Etats-Unis. Sa soeur aînée Sophie, future cinéaste, la fait jouer, adolescente, dans ses premiers travaux. Après le court-métrage Les Sirènes (1989) de Pascal Bonitzer (qu'elle retrouve en 1996 avec Encore), la cadette apparait en 1991 dans le film de fin d'études de sa sœur, Des filles et des chiens, aux côtés d'une autre débutante, Sandrine Kiberlain.

Après une khâgne et des études d'anglais, Hélène Fillières gagne sa vie comme traductrice et en tant que mannequin, tout en promenant sa silhouette élancée chez Jacques Doillon (Amoureuse en 1992) ou Cédric Klapisch (Peut-être). En 1999, Vénus beauté (institut) marque les débuts d'une longue collaboration avec Tonie Marshall : suivront Au plus près du paradis (dans lequel elle a pour mère Catherine Deneuve) puis France boutique. Elle continue par ailleurs d'être dirigée par sa sœur : après un second rôle dans Grande petite, elle incarne en 2000 l'extravagante héroïne de Aïe face à André Dussollier, avec un charme et une fantaisie non dénués de mystère.

Nommée au César du Meilleur espoir féminin en 2002 pour sa composition d'adorable râleuse dans Reines d'un jour, elle affiche une prédilection pour des cinéastes à l'univers très personnel, comme les frères Larrieu, qui la font chanter aux côtés de Mathieu Amalric dans Un homme, un vrai (2002) ou Frédéric Videau. Elle fait partie du casting prestigieux de la saga Les Rois Maudits de Josée Dayan, tout en enchaînant les premiers longs métrages, de Bord de mer à De particulier à particulier. Elle passe derrière la caméra en 2006 en signant le court métrage Mademoiselle Y, une réflexion sur le métier d'actrice avec Jeanne Balibar.

Elle inspire des réalisatrices telles que Pascale Ferran (Lady Chatterley), Claire Denis et surtout Laetitia Masson. Celle-ci lui offre de beaux personnages de femme inadaptée dans Coupable (2008) puis le téléfilm Petite fille. Et c'est à la télévision qu'Hèlène Fillières trouve un de ses rôles les plus marquants, celui de Sandra, héroïne déterminée de la série à succès Mafiosa, diffusée sur Canal+ à partir de 2006. Egalement au générique d'une collection de fictions inspirées des polars de Fred Vargas, elle ne délaisse pas pour autant le grand écran, du côté des films grands public (Les Yeux de sa mère, Les Papas du dimanche) comme du cinéma d'auteur (Low Life, A moi seule). En 2013 sort son premier long métrage comme réalisatrice, Une Histoire d'amour avec Benoît Poelvoorde et Laetitia Casta, d'après un roman évoquant la sulfureuse affaire Edouard Stern.

Après l'arrêt de la série en 2014, Hélène Fillières se fait plus rare sur les écrans. En 2018, elle sort son nouveau long métrage, Volontaire, se déroulant dans le milieu militaire et voyant une jeune recrue (Diane Rouxel) déterminée à s'imposer dans cet univers viril.