Samir Guesmi débute en 1987 dans Jaune revolver, un film policier avec Sandrine Bonnaire et François Cluzet. Après quelques petits rôles, la reconnaissance vient sept ans plus tard avec Malik le maudit en 1994, une comédie dans laquelle il tient le premier rôle, celui d'un jeune beur qui rêve de quitter sa banlieue pour le Canada. Il reçoit pour ce film le prix Michel Simon et le prix d'interprétation au Festival d'Amiens.

Pourtant, Samir Guesmi se fait ensuite discret sur les écrans. Son parcours est divisé entre des seconds rôles dans des films d'action policier (Anthony Zimmer, 2005) et des participations à des films d'auteurs tels que Violence des échanges en milieu tempéré (2004), Selon Charlie (2006) ou Mon colonel (2006). Il collabore aussi régulièrement à des films plus grands publics comme Banlieue 13 ou RRRrrrr !!!, une comédie réalisée par Alain Chabat.

C'est plutôt du côté du court métrage que l'acteur se démarque en participant à des réalisations de cinéastes importants, parmi lesquels Erick Zonca et Guillaume Nicloux, et en jouant dans plus de quinze courts métrages depuis le début de sa carrière. En 2008, il interprète ainsi le rôle du réceptionniste dans le court-métrage oscarisé Le Mozart des pickpockets de Philippe Pollet-Villard.

En habitué du genre policier et du petit écran, il apparaît également au générique de la série télévisée française Engrenages où il incarne un trafiquant de drogue craint et respecté, lui qui eut l'un de ses premiers rôles dans Julie Lescaut en 1994. Qu'il prête ses traits à un policier, un ouvrier ou un truand, Samir Guesmi est désormais - et ce même s'il est rarement en tête d'affiche - un comédien connu par le public français.

Après le succès de Ne le dis à personne en 2008, dans lequel il joue un commissaire à la poursuite de François Cluzet, sa carrière semble définitivement lancée, et il fait des choix de films de plus en plus variés. Il s'affiche dans Ca$h, une comédie policière avec Jean Dujardin, puis part pour le Festival de Cannes grâce à Un conte de Noël, un drame familial d'Arnaud Desplechin au casting trois étoiles. La même année, il tient l'un des rôles principaux de Leur morale... et la nôtre aux côtés d'André Dussollier et Victoria Abril et de la nouvelle comédie dramatique de Bruno Podalydès intitulée Bancs publics (Versailles rive droite).

Cultivant son penchant pour les grands auteurs du cinéma, Samir Guesmi tourne avec Claude Miller (Je suis heureux que ma mère soit vivante, 2009) et Rachid Bouchareb (Hors-la-loi, 2010). Après avoir côtoyé, par le biais de seconds rôles marquants, Benoît Magimel (L'Avocat), Benoît Poelvoorde (Mon pire cauchemar), Ethan Hawke (La Femme du Vème) et Laura Morante (La Cerise sur le gâteau), ce visage familier du cinéma français retrouve Bruno Podalydès et Cannes, avec Adieu Berthe ou l'enterrement de mémé (2012), présenté à la Quinzaine des réalisateurs.

Samir Guesmi poursuit sa carrière avec un rythme toujours soutenu. On peut le voir dans Camille redouble en petit ami de Noémie Lvovsky, qui connaît un succès public important. Il refait également équipe avec Sólveig Anspach pour Queen of Montreuil et L'Effet aquatique, témoignant par la même occasion de son goût pour les comédies dramatiques farfelues. Ce qui ne l'empêche pas de jouer l'un des amis du paysan endetté Guillaume Canet dans Au nom de la terre, un drame rural réaliste. Ou encore de participer aux comédies plus conventionnelles comme La Mélodie et Parents d'élèves, ainsi qu'au film d'action Le Transporteur Héritage.

En 2020, il réalise son premier long métrage, Ibrahim, un drame sobre centré sur la relation complexe entre un père et son fils. L'acteur réalisateur avait, en 2007, déjà abordé cette thématique via un le court métrage C'est dimanche !, qui a obtenu plusieurs récompenses dans des festivals internationaux, dont le Prix du public au Festival de Clermont-Ferrand.