Le charismatique Jeffrey Dean Morgan se destine initialement à une carrière sportive, et ne poursuit des études jusqu'à l'université que pour pouvoir jouer au basket-ball. Lorsqu'il se blesse au genou, il quitte donc la fac avec pour idée de se mettre à peindre et à écrire. Après avoir entamé une brève carrière de graphiste, il fait un voyage à Los Angeles, dont il ne partira plus. En 1991, son premier film, Uncaged, passe inaperçu, mais lui permet de faire ses premiers pas en tant qu'acteur et lui ouvre les portes des castings de nombreuses séries où il apparaîtra, comme Burning zone, menace imminente (1996), dans laquelle il figure au sein de dix épisodes sur dix-neuf.

A partir de 2000, le mouvement s'accélère pour Jeffrey et les tournages s'enchaînent. D'abord dans le monde des séries où il fait des apparitions notamment dans Angel, Tru Calling : compte à rebours et Monk. Il assure également des rôles récurrents comme le personnage de Denny Duquette dans Grey's Anatomy, un malade en attente d'une greffe de cœur et qui va hanter la vie amoureuse du personnage de Katherine Heigl. De plus, il interprète le père des deux héros de Supernatural dès 2005. Côté cinéma, il endosse le costume du shérif dans le film Dead and Breakfast en 2004, puis tourne successivement Kabluey aux côtés de Lisa Kudrow, Shanghai avec John Cusack et Gong Li et enfin P.S. I Love You où il incarne le meilleur ami du mari défunt de Hilary Swank. L'année suivante, il prête ses traits à un beau pompier que ne laissera pas de marbre Uma Thurman dans Un mari de trop.

En 2008, Jeffrey Dean Morgan redouble d'activité. Il participe aux tournages de All good things et du très attendu Watchmen - Les Gardiens de Zack Snyder, où il campe le rôle d'Edward Blake / Le Comédien. Deux ans plus tard, il fait une apparition remarquée en hippie dans Hôtel Woodstock de Ang Lee avant de se transformer en effrayant propriétaire d'Hilary Swank dans The Resident d'Antti Jokinen. En 2011, l'acteur incarne l'inspecteur Brian Heigh, menant l'enquête dans Killing Fields en compagnie de Sam Worthington, puis poursuit son ascension dans le thriller en jouant le père d'une enfant habitée par un démon dans Possédée.

Après avoir campé le terrifiant méchant du western The Salvation en s'opposant à Mads Mikkelsen et pris part à un autre film de tueur en série, Prémonitions, le charismatique acteur accède à un degré de notoriété supplémentaire lorsqu'il est choisi pour se glisser dans la peau d'un personnage très attendu de la série à succès The Walking Dead : celui de Negan, chef d'un groupe de survivants violent et sans pitié. Avec un fusil, Jeffrey Dean Morgan s'en prend ensuite à Gael García Bernal dans le survival tendu Desierto (2016), puis joue le père de Bruce Wayne dans le blockbuster Batman v Superman (id.).